三阴性乳腺癌（TNBC）被认为是最具侵袭性和致死性的乳腺癌。迄今为止，开发TNBC靶向治疗仍然是一个重要挑战。膜联蛋白A2（ANXA2）是一种钙依赖性磷脂酶结合蛋白，ANXA2的表达导致TNBC的侵袭性和多药耐药性增加。现有研究表明，ANXA2可能是抑制TNBC患者新生血管生成及其依赖性肿瘤生长和转移的一个有希望的治疗靶点。但很少有关于ANXA2的有希望的抑制剂报道。在使用抗ANXA2抗体的异种移植模型中，对抑制人类乳腺肿瘤生长的效果进行了有限的研究。在这项研究中，发现了第一个小分子ANXA2抑制剂5α-环氧土木香内酯（5α-EAL，图1）。
图15α-EAL的化学结构
5α-环氧土木香内酯（5α-EAL）（图1）是一种结构独特的倍半萜内酯，最初从一种菊科旋覆花属的中国特有植物总状土木香中分离得到，产率极低。因此作者通过另一种植物土木香分离得到土木香内酯，进一步进行氧化得到5α-EAL。
首先，通过MTT活性测定，在不同的癌细胞系中评估5α-EAL对肿瘤细胞的抗增殖作用，发现5α-EAL在不同的微摩尔浓度下减弱所有选定肿瘤细胞的生长），其中MDA-MB-和4T1癌细胞的IC50值分别达到16.03±1.4和18.39±2.5μM。深入分析显示，5α-EAL降低了MDA-MB-和4T1癌细胞的集落形成能力（图2C,D）。如图2E所示，对于MDA-MB-和4T1癌细胞，给予5α-EAL的组以剂量依赖性方式具有更小的肿瘤球。以上实验结果表明5α-EAL在体外可拮抗TNBC细胞和干细胞的增殖。
图25α-EAL在体外对三阴性乳腺癌细胞和干细胞的增殖均有抑制作用
然后作者研究了5α-EAL是否能有效抑制TNBC在体外的迁移。图3A,B表明两种TNBC细胞的迁移能力均受到5α-EAL的显著影响，基于transwell的分析表明5α-EAL的治疗也降低了侵袭能力（图3C,D）。因此作者进一步评估了5α-EAL在体内的抗肿瘤潜力。为克服直接口服5α-EAL而血浆中内酯环的快速水解效率较低的问题，设计并制备了5α-EAL的前药2（图3E），在体内采用前药2替代5α-EAL。根据图3F，5α-EAL治疗诱导的肿瘤生长抑制率（TGI）平均达到30%左右，表明5α-EAL抑制体内肿瘤生长，而5α-EAL治疗对小鼠平均体重没有明显影响（图2G）。多个实验数据表明5α-EAL在体外和体内都能明显损害TNBC细胞的侵袭能力。
图35α-EAL在体内外均能减弱TNBC细胞的侵袭能力
接下来作者为了阐明5α-EAL抑制TNBC干细胞增殖和TNBC细胞转移的机制，制备了5α-EAL化学探针用于亲和pull-down实验。根据图4A方案合成了阳性探针（Probe）和阴性探针（NC），将生物素连接至结构上。肿瘤球分析的结果表明，阳性探针（Probe）在50μM左右保留了抗BCSC活性，而阴性探针（NC）完全丧失了该活性（图4B）。
图45α-EAL化学探针的合成及生物学评价
之后作者进行了pull-down实验，以确定与5α-EAL选择性反应的直接靶点。与NC富集的谱带相比，在40kDa左右观察到一条不同的谱带被探针特异性沉淀（图5A）。胰蛋白酶消化后，用液相色谱-质谱法，发现了膜联蛋白A2（图5B）。接下来，进一步进行免疫印迹以确认ANXA2存在于探针组的沉淀物中，而不是NC组（图5C）。上述数据表明5α-EAL直接靶向ANXA2。
图55α-EAL直接靶向ANXA2
为了测定5α-EAL对膜联蛋白A2的特异性反应残留物，纯化的重组人ANXA2蛋白（hANXA2）与5α-EAL一起培养或不一起培养后，通过液相色谱基质辅助激光解吸/电离飞行时间（LC-MALDI-TOF），LC-MS/MS分析以及计算和数据库检索可以确定5α-EAL与蛋白质Cys9残基处的巯基发生了共价反应。此外，还获得了小分子和蛋白质的共晶体，以阐明它们的直接结合模式。
Cys9是在ANXA2和SA10之间构建异源四聚体复合物的重要结合位点，其显著影响乳腺癌细胞的增殖和转移。因此分别用抗ANXA2或抗SA10抗体沉淀ANXA2/SA10复合物，然后进行western印迹分析，以评估加入或不加入5α-EAL抑制ANXA2和SA10之间异四聚体的形成。从图6可以看出，5α-EAL将显著减少SA10和ANXA2之间的相互作用。即5α-EAL在体外显著抑制ANXA2和SA10复合物的形成。
图65α-EAL干扰ANXA2和SA10复合物的形成
据报道，E-钙粘蛋白向细胞膜的转运受ANXA2/SA10复合物的调节。为了评估5α-EAL是否能阻断TNBC细胞的这一功能，在5α-EAL处理后，首先评估细胞胞浆和细胞膜中E-钙粘蛋白的表达。如图7A所示，5α-EAL增加了E-钙粘蛋白在细胞质中的积累，而位于细胞膜上的E-钙粘蛋白数量显著减少。
为了进一步评估5α-EAL对体内种植转移的影响，建立了模拟TNBC肺转移的动物模型。结果如图7C，D所示。与载体组相比，口服前药2后几乎没有观察到荧光。5α-EAL显著降低肺转移负担（图7E），在前药2组中发现较少的肺转移（图7F）。与对照组相比，5α-EAL给药组转移组织中ANXA2和E-钙粘蛋白的膜表达下调（图7G，H）。总之，5α-EAL通过降低细胞膜上的E-钙粘蛋白水平，部分抑制次级部位的种植性转移。
图75α-EAL通过降低膜E-钙粘蛋白来抑制远处的种植转移
综上所述，本研究中发现天然产物5α-EAL是第一个通过直接和共价靶向ANXA2的Cys9来抑制ANXA2功能的小分子。该天然产物可显著抑制ANXA2和SA10异源四聚体复合物的形成，该复合物能够将E-钙粘蛋白运输到膜上。此外，发现5αEAL具有潜在的抗乳腺癌干细胞（BCSCs）活性。上述发现可作为一种可行的策略，通过靶向ANXA2开发新的抗TNBC疗法。5α-EAL及其水溶性前药作为潜在的抗BCSC先导化合物仍在研究中。
DOI:10./acs.jmedchem.1c
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